乙酰苯胺的制备

网上有关“乙酰苯胺的制备 ”话题很是火热，小编也是针对乙酰苯胺的制备寻找了一些与之相关的一些信息进行分析，如果能碰巧解决你现在面临的问题，希望能够帮助到您。

一、实验目的

1．掌握由苯胺乙酰化制备乙酰苯胺的原理和方法。

2．掌握分馏的原理及分馏装置的安装和操作。

3．巩固重结晶的操作方法。

二、实验原理

反应式：

芳胺的酰化在有机合成中的作用：

（1）乙酰化反应常被用来“保护”伯胺和仲胺官能团，以降低芳胺对氧化性试剂的敏感性。

（2）氨基经酰化后，降低了氨基在亲电取代反应（特别是卤化）中的活化能力，使其由很强的第I类定位基变成中等强度的第I类定位，使反应由多元取代变为有用的一元取代。

（3）由于乙酰基的空间效应，往往选择性地生成对位取代产物。

（4）在某些情况下，酰化可以避免氨基与其它功能基或试剂（如RCOCl，-SO2Cl，HNO2等）之间发生不必要的反应。

作为氨基保护基的酰基基团可在酸或碱的催化下脱除。

芳胺可用酰氯、酸酐或冰醋酸加热来进行酰化，使用冰醋酸试剂易得，价格便宜，但需要较长的反应时间，适合于规模较大的制备。虽然乙酸酐一般来说是比酰氯更好的酰化试剂，但是当用游离胺与纯乙酸酐进行酰化时，常伴有二乙酰胺[ArN(COCH3)2]副产物的生成。

三、操作步骤

实验步骤及过程

1．投料：

在25mL圆底烧瓶中，加入10mL苯胺、1.5mL冰醋酸及少许锌粉（约0.01g）然后装上一短的刺形分馏柱，其上端装一温度计，支管通过支管接引管与接受瓶相连，接受瓶外部用冷水浴冷却。

2.反应

将圆底烧瓶在石棉网上用小火加热，使反应物保持微沸约15min。然后逐渐升高温度，当温度计读数达到100℃左右时，支管即有液体流出。维持温度在100~110℃之间反应约1.5h ，生成的水及大部分醋酸已被蒸出

3、分离提纯，此时温度计读数下降，表示反应已经完成。在搅拌下趁热将反应物倒入10mL水中，冷却后抽滤析出的固体，用冷水洗涤。粗产物用水重结晶，产量0.6~0.9g ，熔点113~114℃(文献值114.3℃)。

四、数据记录和处理

略

五、实验注意事项

1．久置的苯胺色深有杂质，会影响乙酰苯胺的质量，故最好用新蒸的苯胺。另一原料乙酸酐也最好用新蒸的。

2．加入锌粉的目的，是防止苯胺在反应过程中被氧化，生成有色的杂质。通常加入后反应液颜色会从**变无色。但不宜加得过多，因为被氧化的锌生成氢氧化锌为絮状物质会吸收产品。

3．产物之一水和原料醋酸的沸点相差很小。所以用分馏的方法分出水。可用10 mL量筒作为分馏接收器，量筒置于盛有冷水的烧杯中。收集乙酸和水的总体积约2.25 mL。

4．不可以用过量的水处理乙酰苯胺。乙酰苯胺于不同温度在100g水中的溶解度为:

5．不应将活性炭加入沸腾的溶液中，否则会引起暴沸，会使溶液溢出容器。溢出容器。

6．反应物冷却后，固体产物立即析出，沾在瓶壁不易理处。故须趁热在搅动下倒入冷水中，以除去过量的醋酸及未作用的苯胺（它可成为苯胺醋酸盐而溶于水）。

六、思考题

本反应为什么要控制分馏柱顶端温度在105℃？

答：主要由原料CH3COOH（b.p.118℃）和生成物水（b.p.100℃）的沸点所决定。控制在105℃,这样既可以保证原料CH3COOH充分反应而不被蒸出，又可以使生成的水立即移走，促使反应向生成物方向移动，有利于提高产率。

实验装置

分馏反应装置

几种常用的分馏柱

热过滤装置

减压抽滤装置

实验药品数据

中文名称:

苯胺；阿尼林油

英文名称:

aniline;phenylamine;aminobenzene

描述:

相对分子量或原子量93.13

密度1.0216

熔点（℃）-6.2

沸点（℃）184.4

性状无色油状液体，有强烈气味，有毒。

溶解情况稍溶于水，与乙醇、乙醚、苯混溶。

用途用途很广，用于制染料、药物、橡胶硫化促进剂等，本身也用于染黑色和测定油的苯胺点等。

制备或来源由硝基苯用铁与酸还原制得。

其他暴露与空气变色。

中文名称:

乙酸；醋酸；冰醋酸

英文名称:

acetic acid

描述:

相对分子量或原子量60.05密度1.049

熔点（℃）16.7沸点（℃）118

闪点（℃）57，39（闭式）

蒸气压（Pa）1573（20℃），467（0℃），55595（100℃）

粘度 mPa·s（20℃）11.83（20℃），10.97（30℃），8.18（40℃），4.3（1)

折射率1.3718毒性LD50(mg/kg) 小鼠经口4960。

性状无色澄清液体，有刺激气味

溶解情况溶于水、乙醇、乙醚等

用途重要的化工原料，可制备多种乙酸衍生物如乙酸酐、氯乙酸、乙酸纤维素等，适用于生产对苯二甲酸、纺织印染、发酵制氨基酸，也作为杀菌剂。

制备或来源工业生产方法有乙醇、乙烯经乙醛的氧化法、烷烃液相氧化法和甲醇羰化法。也可由木焦油中用溶剂萃取分出。

其他

无水乙酸俗称冰醋酸，在16摄氏度以下凝固，凝固时体积膨胀。普通的乙酸含纯乙酸36% ，无色透明液体。

中文名称:

乙酰基苯胺；退热冰；N-苯基乙酰胺

英文名称:

acetanilide

描述:

相对分子量或原子量135.17

密度1.2105

熔点（℃）114-116

沸点（℃）305

闪点（℃）160

性状白色有光泽的鳞片状晶体。

溶解情况溶解度：水0.56（25℃）、3.5（80℃）、18（100℃）；乙醇36.9（20℃），甲醇69.5（20℃），氯仿3.6（20℃），微溶于乙醚、丙酮、甘油和苯。不溶于石油醚。

用途用于制药物、染料、橡胶硫化促进剂、合成樟脑等。

制备或来源由苯胺与乙酰氯或乙酸酐共热而得。

怎样测定蛋白质的含量最合理

显示用液晶材料是由多种小分子有机化合物组成的,现已发展成很多种类, 例如各种联苯腈、酯类、环己基(联) 苯类、含氧杂环苯类、嘧啶环类、二苯乙炔类、乙基桥键类和烯端基类以及各种含氟苯环类等。人们通常根据液晶形成的条件,将液晶分为溶致液晶( Lyot ropic liquid crystal s ) 和热致液晶( Thermot ropic liquid crystal s) 两大类。 1.1 溶致液晶将某些有机物放在一定的溶剂中,由于溶剂破坏结晶晶格而形成的液晶,被称为溶致液晶。比如:简单的脂肪酸盐、离子型和非离子型表面活性剂等。溶致液晶广泛存在于自然界、生物体中,与生命息息相关,但在显示中尚无应用。 1.2 热致液晶热致液晶是由于温度变化而出现的液晶相。低温下它是晶体结构,高温时则变为液体,这里的温度用熔点( Tm) 和清亮点( Tc ) 来标示。液晶单分子都有各自的熔点和清亮点,在中间温度则以液晶形态存在。目前用于显示的液晶材料基本上都是热致液晶。在热致液晶中,又根据液晶分子排列结构分为三大类:近晶相 (Smectic) 、向列相(Nematic) 和胆甾相(Cholesteric) 。 1. 2. 1 胆甾相液晶这类液晶大都是胆甾醇的衍生物。胆甾醇本身不具有液晶性质,其中只有当 O H 基团被置换,形成胆甾醇的酯化物、卤化物及碳酸酯,才成为胆甾相液晶。并且随着相变而显示出特有颜色的液晶相。胆甾相液晶在显示技术中很有用, TN、 STN 等显示都是在向列相液晶中加入不同比例的胆甾相液晶而获得的。另外, 温度计也应用于此液晶。 1. 2. 2 近晶相液晶虽然目前液晶显示技术中主要应用的是向列相液晶,而近晶相液晶黏度大, 分子不易转动,即响应速度慢,被认为不宜作显示器件。但是向列相液晶显示模式几乎已接近极限,从TN 到STN 直至FSTN(Formulated Super Twisted Nematic) 格式化超级扭曲向列,对其应用没有新的理论模式。因而,人们将目光重新转移到了近晶相液晶上,目前各近晶相中的手性近晶C 相,即铁电相引起人们广泛兴趣。铁电液晶具备向列相液晶所不具备的高速度(微秒级) 和记忆性的优异特征,它们在最近几年得到大量研究。 1. 2. 3 向列相液晶向列相液晶又称丝状液晶。在应用上,与近晶相液晶相比,向列相液晶各个分子容易顺着长轴方向自由移动,因而黏度小,富于流动性。向列相液晶分子的排列和运动比较自由,对外界作用相当敏感,因而应用广泛。向列相液晶与胆甾相液晶可以互相转换,在向列相液晶中加入旋光材料,会形成胆甾相,在胆甾相液晶中加入消旋光向列相材料,能将胆甾相转变成向列相。 2 液晶显示中所用液晶材料的主要分类液晶材料介于晶体与液体之间性质,兼有液体与晶体的特性,一方面,液晶具有流体的流动特性;另一方面,液晶又呈现出晶体的空间各向异性,包括介电特性、磁极化、光折射率等空间各向异性。液晶分子的部分有序排列还使得液晶具有类似晶体的、能承受扰乱这种秩序的切变应力。即使液晶具有切变弹性模量。对于实际显示器件性能的影响,液晶材料有许多技术参数,包括光电参数与物性参数,主要有介电各向异性Δε 、双折射率Δn 、体积黏度η、弹性常数K 、相变温度Tm/ Tc (熔点\ 清亮点) 和液晶电阻率ρ等。根据液晶的上述特性产生出来的光电效应,把液晶对电场、磁场、光线和温度等外界条件的变化在一定下装换成可视信号,就可以制成显示器,即液晶显示器件。目前,各种形态的液晶材料基本上都用于开发液晶显示器,现在已开发出的有各种向列相液晶、聚合物分散液晶、双(多) 稳态液晶、铁电液晶和反铁电液晶显示器等。而在液晶显示中,开发最成功、市场占有量最大、发展最快的是向列相液晶显示器。按照液晶显示模式, 常见向列相显示就有TN (扭曲向列相) 模式、H TN (高扭曲向列相) 模式、 STN (超扭曲向列相) 模式、TF T (薄膜晶体管) 模式等。其中TF T 模式是近10 年发展最快的显示模式。 TN ( Twist Nematic) 扭曲向列型液晶材料 2. 1 TN 型液晶材料的发展起源于1968 年,当时美国公布了动态散射液晶显示 (DSM2LCD) 技术。但由于提供的液晶材料的结构不稳定性,使它们作为显示材料的使用受到极大的限制。1971 年扭曲向列相液晶显示器( TN2LCD) 问世后, 介电各向异性为正的TN2液晶材料便很快开发出来;特别是1972年相对结构稳定的联苯腈系列液晶材料由Gray G等合成出来后,满足了当时电子手表、计算器和仪表显示屏等LCD 器件的性能要求,从而真正形成了TN2LCD 产业时代。 TN2LCD 用的液晶材料已发展了很多种类。它们的特点是分子结构稳定,向列相温度范围较宽,相对黏度较低。不仅可以满足混合液晶的高清亮点、低黏度,而且能保证体系具有良好的低温性能。联苯环类液晶化合物的△n 值较大,是改善液晶陡度的有效成分。嘧啶类化合物的K33/ K11 值较小,只有0. 60 左右,在 TN2LCD 和STN2LCD 液晶材料配方中,经常用它们来调节温度序数和△n 值。而二氧六环类液晶化合物是调节“多路驱动”性能的必需成分。TN 液晶一般分子链较短,特性参数调整较困难,所以特性差别比较明显。 2. 2 STN( Super TN) 超扭曲向列相型液晶材料自1984 年发明了超扭曲向列相液晶显示器(STN2LCD) 以来,由于它的显示容量扩大,电光特性曲线变陡,对比度提高,要求所使用的向列相液晶材料电光性能更好,到80 年代末就形成了STN2LCD 产业,其代表产品有移动电话、电子笔记本、便携式微机终端。STN 型与TN 型结构大体相同,只不过液晶分子扭曲角度更大一些,特点是电光响应曲线更好,可以适应更多的行列驱动。STN2LCD 用混晶材料的主要成分是酯类和联苯类液晶化合物,这两类液晶黏度较低,液晶相范围较宽,适合配制不同性能的混晶材料。另外为了满足STN 混晶的大K33/ K11 值和适度△n 的要求,通常需要在混晶中添加炔类、嘧啶类、乙烷类和端烯类液晶化合物。调节混晶体系的△n 通常用炔类单体、嘧啶类单体乙烷类单体等。K33/ K11 值对STN2LCD 的阈值锐角有很大影响, 较大的K33/K11 值使显示有较高的对比度。为了提高K33/K11 值,往往需要在混晶中添加短烷基链液晶化合物和端烯类液晶化合物。 2. 3 TFT( Thin Film Transistor) 薄膜晶体管显示型液晶材料由于采用薄膜晶体管阵列直接驱动液晶分子,消除了交叉失真效应,因而显示信息容量大;配合使用低黏度的液晶材料,响应速度极大提高,能够满足视频图像显示的需要。因此, TF T2LCD 较之TN型、STN 型液晶显示有了质的飞跃。 TF T2LCD 用液晶材料与传统液晶材料有所不同。除了要求具备良好的物化稳定性、较宽的工作温度范围之外, TF T2LCD 用液晶材料还须具备以下特性:低黏度、高电压保持率、与TF T2LCD 相匹配的光学各向异性( △n) 。目前针对 TFT2LCD 用液晶材料的合成设计趋势集中于以下几个方面: (1) 以氟原子或含氟基团作为极性端基取代氰基; (2) 在液晶分子侧链、桥键引入氟原子来调节液晶相变区间、介电各向异性等性能参数; (3) 含有环己烷,尤其是双环己烷骨架的液晶分子得到广泛重视; (4) 乙撑类柔性基团作桥键的液晶。在液晶显示材料中, 液晶材料大都是由几种乃至十几种单体液晶材料混合而成。向列相液晶和胆甾相液晶目前已具有非常广泛的应用,尤其是在液晶平板显示器上的应用,市场极大。随着液晶化合物种类的不断增加,液晶化合物的结构与性能之间的关系逐渐为人们所认识。反过来,由性能- 结构之间的关系又可以指导具有新型结构、具备特定功能的液晶分子的合成。单一的化合物难以满足实际应用中的苛刻要求, 通过将不同的液晶单体进行科学混配,则可以弥补相互性能上的不足之处。这样, 通过合成出在某些性能上具有独到之处的液晶化合物,并将其应用于混合液晶配方中,也能达到提高显示性能的目的。二胆甾液晶自1992 年发现胆甾相液晶具有零场下多稳定相态织构现象以来,反射式胆甾相液晶显示(Cholesteric liquid crystal display ,简称:Ch2LCD) 已发展成为一种新型显示模式。最突出的优点是具有零场记忆特性,在零电场时,能长期保持显示内容,其能耗只有TFT2LCD 的1/ 8 左右。由于不需要偏振片和背光源,具有高反射能力和宽视角,能够实现类似纸般的阅读效果,特别适用于电子书籍阅读器、商业广告等领域。美国、日本、欧洲和中国等国家投入了大量人力、物力从事这方面的基础研究和应用开发工作,发展很快。 2000 年开发出黄绿模式胆甾相液晶电子书籍 ,2001 年开发出黑白模式电子书籍2003 年已发展到全彩色模式 e2book ,成为近几年液晶显示领域的一个热点。显示用胆甾相液晶材料是由宽温向列相液晶组合物(Nematic liquid crystal components) 和手性组合物(Chiral components) 配制而成,具有平面织构(Planar Texture) 、焦锥织构(Focal Conic 与其他液晶材料相比,胆甾相液晶材料的螺 Texture)等多种稳定相态的液晶材料。距较短、双折射率大、手性组分含量高。 1 胆甾相液晶材料的性能要求胆甾相液晶材料独特的螺旋结构决定了它特殊的光学特性[7 ] 。对于反射式液晶显示,其液晶材料必须满足Bragg 方程(1) ,即中心反射波长(λ0) 与液晶材料的螺矩( p) 及其平均折射率(n )成正比:λ0 = .n p (1)由于液晶材料具有介电各向异性、折射率ne 和no ,平均折射率(n ) 为( ne + 2 no ) / 3。例如,若一液晶的 ne = 1. 70 , no = 1. 50 ,为了反射出波长λ=550nm 的可见光,其螺矩应约为 350nm。另一方面,液晶显示的反射光谱波带(Δλ) 是与液晶材料的螺矩( p) 及双折射率(Δn = ne - no)成正比:Δλ = pΔn (2)从公式(2) 中可见,当p 值一定时, 在满足Bragg反射(即Δλ值一定) 的前提下, 提高胆甾相液晶材料的Δn ,有利于改善液晶反射效果。液晶材料的螺距p 和手性掺加剂的螺旋扭曲力常数 (Helical Twisting Power ,简称HTP 值) 及其在液晶组合物中的含量Xc 关系是:p = [ (HTP) Xc ] - 1 (3)胆甾相液晶材料的HTP 值是由手性分子自身性质决定。当p 值一定时,手性分子的HTP 值越大,在其液晶材料中的含量( Xc)相对越少,越有利于胆甾相液晶的性能改善。由于不同Ch2LCD模式具有不同的螺矩,只有通过调节不同HTP 值的手性组分及其在液晶材料中的含量来改变螺矩和反射波长(或显示屏颜色) 。在胆甾相液晶材料中,其Δn 、介电各向异性(Δε) 是由向列相液晶组合物性能决定,其粘度是由向列相液晶组合物和手性组合物共同决定。要改善胆甾相液晶显示性能,降低工作电压、增加亮度、提高响应速度和工作温度范围、实现黑白或全色彩的高对比度显示,除了改进显示方法外,必须在提高液晶材料的双折射率、扩大介电各向异性、降低粘度、减少手性组分含量等方面解决问题。因此,设计与合成新型高HTP 值的手性化合物分子,开发低粘度、高Δn 值、高Δε值液晶分子已成为近几年的重要新课题。 2 胆甾相液晶的合成自 18 88 年液晶被发现后人们对其特殊性质的认识不断深入。它具有力、光、电、声、热、气等多种效应,这些与众不同的性质使之作为一种新材料被越来越广泛地应用到各个领域。胆固醇脂类液晶在一定条件下随温度、磁场、电场、机械应力、气体浓度的变化发生色彩的变化,可用于制作液晶温度计、气敏元件、电子元件、变色物质等,还可用于无损探伤、微波测量、疾病诊断、定向反应等化学、化工、冶金、医学领域,其新的合成和应用报道层出不穷,合成方法也不断改进。本文用羧酸酰氯与胆固醇反应合成胆甾型液晶。许多文献在反应中都加入了氯化氢吸收剂,如 N,N 一二甲基苯胺、毗吮等, 我们在实践中观察到该法有时分离纯化麻烦、收率不高,但改进后的蒸出氯化氢法效果良好,并用该法成功地合成了 Z 一 51 一二十四碳烯酸胆固醇脂。三实验部分熔点测定使用 APPAREIL、 MONAND 一 JOUAN 熔点测定仪,温度计未较正;红外光谱使用岛津一 45 0 型红外光谱仪(除标明外均为嗅化钾压片);D SC 曲线使用岛津一 40 综合热分析仪;薄层检测使用硅胶 G F 25 4(200 一 62 0 目,上海化学试剂采购供应站);柱层析使用 60 一 10 目硅胶;二十四碳烯酸自己合成;其余药品均为化学纯商品。 3.1 胆固醇丙酸脂的合成在 250 m l 三颈瓶中加入 54.5 9(0.7 3 6m o l)丙酸、 6.3 9(0.700 m o l)新蒸 7 氯化亚矾、几滴 N,lN 一二甲基甲酞胺,水浴回流 2~3 h,再向反应瓶中加入 4 1 9(0.106 m o l)胆固醇、13 0m l(1.122 m o l)N,N 一二甲基苯胺,水浴回流 3h 。以 30 份石油醚和一份乙醚混合液为展开剂薄层检测反应终点反应完后取上层蒸出 20℃以下的馏份,冷却后乙醇重结晶 3 次 ,得白色固体 34.5 9,产率 73.5%,R f 值为 0.70(石油醚:乙醚一 30:1),熔点见表 l(下同)。 3.2 胆固醇苯甲酸醋的合成采用胆固醇与苯甲酸脂的摩尔比为 1:2 的用量仿上操作,产率“%,R f 值为 0.54 (展开剂同上) 3.3 胆固醇壬酸脂的合成在 2 50 m l 三颈瓶中加入 8.2 9(0.0518m o l)壬酸、1 1.9 9(0.100 m o l)新蒸氯化亚讽、几滴 N,N 一二甲基甲酞胺,水浴回流 3 h,减压蒸去低沸点物质,然后加入 10 g(0.025 mol)胆固醇,通氮气,120℃左右回流 l h,同时驱赶 HC I,薄层检测反应终点(同上展开剂)。反应完后无水乙醇重结晶 3 次,得白色晶体 10.5 g,产率 74.5%,R f 值为 0.5 6。 3.4 胆固醇丁酸脂的合成制丁酸氯时让丁酸过量少许,不再减压蒸馏,其余仿 1.3 操作。产率 17%,R f 值为 0.07。 3.5 胆固醇油醇碳酸脂的合成胆固醇油醇碳酸脂的合成 3.5.1 光气的制备在 250 m l 的三颈瓶中加入 20g50%的发烟硫酸,水浴加热,以 1 滴/5s 的速度滴入四氯化碳即可产生连续稳定的光气。 3.5.2 胆固醇氯甲酸脂的制备把 15g(0.038 mol)胆固醇溶于干燥的 200lm 乙醚中,并倾入 250 ml 的三颈烧瓶,通入连续稳定的光气至成**溶液,再持续 1~2 h,用氮气驱尽残余光气,薄层检测反应终点(用 7 份石油醚和 l 份乙醚的混合液为展开剂),反应完后蒸去含光气的乙醚,丙酮重结晶 1 次,得白色产品 10.7g,产率 71.3% 。熔点 117℃ 文献值 118~119℃ R f 值为 0.7 0(石油醚:乙醚~7:1) 3.53 胆固醇油醇碳酸脂的合成在装有冷凝管滴液通氮气导管的 250 m l 的三颈烧瓶中放入 13.47g(0.030 mol 胆固醇氯甲酸脂,20 ml 无水苯溶之,再加入 8.04g(0.030 mol)油醇,通氮气,搅拌下滴加由 2.37g(0.030 mol)毗咙和 3 0 m l 成的溶液滴加完毕继续搅拌 Z h,滤去白色沉淀,滤液蒸出苯得粗制品,用 10 份石油醚和 1 份乙醚组成的洗脱剂柱层析,收集 R f 值为 0.56 的物质,蒸去溶剂得稠状物,产率 50%。 I R(液膜,V,max:,cm 一’):1740(C =O)、1250(C 一 O 一 C) 3.6 胆固醇二十四碳烯酸脂的合成把 15 g(0.041 mol)Z 一 1 5 一二十四碳烯酸 5.0 g(0.420 mol)新蒸氯化亚矾、几滴 N,N 一二甲基甲酞胺加入到 250 ml 的三颈烧瓶中,水浴反应至无气泡产生后再持续半小时,减压蒸去低沸点物质,然后加入 9.0 g(0.023 mlo)胆固醇, 水浴回流 10 mni 再通氮气并加热至 130℃反应 l h,薄层检测反应终点,反应完后冷却, 以石油醚:乙醚~30:1 的溶液为洗脱剂用硅胶进行柱层析,收集 Rf 值为 0.55 的物质,蒸去溶剂,放里数天,得白色蜡状固体 14.6g 产率 84.5% 熔点:39.4℃ 清亮点:50.9℃

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

以下引用：

6种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)

2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)

(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4?5h2o）和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h2o），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2. 器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

（一）实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg 。通常测定范围是20~250mg。

（二）试剂与器材

1.试剂

（1）试剂甲：

（a）10克 na2co3，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h2o）。溶解于500毫升蒸馏水中。

（b）0.5克硫酸铜（cuso4?5h2o）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（na2wo4?2h2o）,25克钼酸钠（na2moo4?2h2o）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（li2so4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈**（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准naoh滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

2. 器材

（1）可见光分光光度计

（2）旋涡混合器

（3）秒表

（4）试管16支

（三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2 ，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

（250mg/ml）

未知蛋白质 0.2 0.4 0.6

（约250mg/ml）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4

试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

每管中蛋白质的量（mg）

吸光度值（a700）

2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

（一）试剂

1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

3. 标准蛋白质溶液：同基本法。

（二）操作步骤

测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。

改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

（一）实验原理

双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰lowry法的k+、na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100 、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

（二）试剂与器材

1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa) ，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：

（1）可见光分光光度计

（2）旋涡混合器

（3）试管16支

（三）操作方法

1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01 、0.02、0.04、0.06、0.08 、0.1ml ，然后用无离子水补充到0.1ml 。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

(1.0mg/ml)

未知蛋白质 0.02 0.04 0.06

(约1.0mg/ml)

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04

考马斯亮蓝

g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

每管中的蛋

白质量（mg）

光吸收值

（a595）

（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml h2o, 考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。

0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

六、紫外吸收法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（nh4）2so4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因ph的改变而有变化，因此要注意溶液的ph值，测定样品时的ph要与测定标准曲线的ph相一致。

下面介绍四种紫外吸收法：

1. 280nm的光吸收法

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值a280 。蛋白质浓度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，a280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（a1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（a1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值a1％1cm,?称为百分吸收系数或比吸收系数。

蛋白质浓度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)

(q 1%浓度?10mg/ml)

例：牛血清清蛋白： a1％1cm=6.3 (280nm)

溶菌酶： a1％1cm=22.8 (280nm)

若查不到待测蛋白质的a1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（bsa）。

标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：

管号 1 2 3 4 5 6

bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0

a280

用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度a280，以a280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的a280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管a280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的a1％1cm,280nm

2. 280nm和260nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

纯蛋白质的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8

纯核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其a280和a260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。

3. 215nm与225nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：

吸收差d= a215 －a225

以吸收差d为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，nacl 、（nh4）2so4以及0.1m磷酸、硼酸和tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005m以下才无显著影响。

4. 肽键测定法

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值a238，以a238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。

本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。